“모든 물질은 고유의 흡광 파장을 가진다”
핵산 정량의 원리는 여기서부터 시작됩니다.
모든 핵산은 DNA, RNA, Single Stand, Double Stand 상관 없이 260 nm 파장의 빛을 최대로 흡수합니다. 단백질을 만드는 펩타이드 구성원인 Tryptophan, Tyrosin 등은 280 nm 파장의 빛을 최대로 흡수합니다.
측정 파장 & 타겟
일반적으로 핵산 정량은 아래 세 파장을 측정합니다.
| 측정 파장 | 측정 타겟 |
| 230nm | Phenol, Guanidine 등 시약류에 포함된 Organic Compound |
| 260nm | DNA, RNA 등 핵산 |
| 280nm | Tryptophan, Tyrosin 등 Aromatic Ring 구조를 포함하는 펩타이드 (단백질 구성원) |
DNA, RNA등의 핵산을 추출하기 위해서는 phenol, gunanidine이 포함된 시약을 사용하므로, 이 시약류의 오염 정도를 확인하기 위해 230 nm 파장을 측정합니다.
오염도 측정
또한, 핵산은 대부분 Mammalian Cell*에서 추출하거나 박테리아에서 추출하는 등 단백질에 쌓여 있는 핵산을 추출하는 작업이므로, 단백질 오염이 발생할 수 밖에 없습니다. 따라서, 이 오염 정도를 측정하기 위해 280 nm 파장을 측정합니다.
| Ratio | 목적 | Pure DNA | Pure RNA |
| 260 / 280 nm | Protein 오염도 측정 | ~ 0.8 | ~2.0 |
| 260 / 230 nm | Organic Compound 오염도 측정 | 2.0 ~ 2.2 | 2.0 ~ 2.2 |
dsDNA, ssDNA, ssRNA 측정
그렇다면, 모든 핵산은 260 nm 파장의 빛을 최대로 흡수하는 반면, dsDNA, ssDNA, ssRNA는 왜 구분해서 측정 할까요?
바로 흡광 계수(extinction coefficient) 때문!
모든 물질은 특정 파장에서의 흡광 계수 값을 가지게 되는데, 흡광 계수는 그 파장의 빛을 얼마나 많이 흡수 하느냐를 나타내는 하나의 지표라고 볼 수 있습니다.
흡광 계수와 OD 값
아래처럼 각 핵산 별 260 nm 파장에 대한 흡광 계수와 그에 따라 흡광도(Optical density, OD) 1이 나타내는 농도 값을 계산한 것을 볼 수 있습니다.
핵산 종류
Nucleic Acid Typev | 흡광 계수
Extinction Coefficient
(㎍/㎖)-1 cm-1 | OD 1일 때 농고
Concentration
(㎍/㎖) if OD=1
|
| Double-Stranded DNA (dsDNA) | 0.020 | 50 ㎍/㎖ |
| Single-Stranded DNA (ssDNA) | 0.027 | 37 ㎍/㎖ |
| Single-Stranded RNA (ssRNA) | 0.025 | 40 ㎍/㎖ |
예시로 이해하기!
Q ) 나의 dsDNA 샘플이 260 nm 에서 OD 값이 2라면?
A ) 내 샘플 OD 값은 100 µg/ml
혹시..
핵산 종류를 잘못 선택하고 흡광도를 측정했나요?
핵산 정량에 대한 원리를 이해했다면
내 샘플에 맞는 농도 값을 계산할 수 있을거예요!
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