밀 테니 키트 이용 (with Tumor Dissociation Kit, mouse (#130-096-730))

[필요 시약 및 장비]

1. RPMI1640 또는 DMEM

2. Tumor Dissociation kit, mouse (Enzyme D, R, A 와 BufferA로 구성)

2. MACS SmartStrainer

3. gentleMACS C Tubes

4. gentleMACS Octo Dissociator with Heaters(이하 GMOH)

[시약 준비단계]

1. 각 Enzyme들은 동결건조(lyophilized) 되어 있기 때문에 RPMI1640 또는 DMEM 및 Buffer A를 사용해 활성화 시켜줍니다. 

   Enzyme D는 3㎖, Enzyme R은 2.7㎖의 RPMI1640을 넣어주고 Enzyme A는 1㎖의 BufferA를 넣어줍니다. 

2. 활성화 된 시약들은 분주 시켜 -20℃에서 냉동보관 시켜줘야 되며 사용 기한은 6개월입니다. 

[Tumor Dissociation Protocols]

1. 종양 조직은 Soft/Medium 또는 Tough로 구분 지어지며 아래 Table 1을 참고해 실험을 진행하면 됩니다.

 Table 1.

2. gentleMACS C Tube에 2.35㎖ RPMI1640 또는 DMEM, 100㎕ Enzyme D, 50㎕ Enzyme R 그리고 12.5㎕ Enzyme A를 넣어 Enzyme Mix를 만들어 줍니다.

3. 지방, 섬유질 그리고 괴사 조직을 제거한 2-4㎜의 종양 조직을 앞서 준비한 Enzyme Mix에 넣어줍니다.

4. 해당 C tube를 잘 닫아 준 후 GMOH에 장착 시키고 효소 반응을 위한 Heating Unit 또한 장착 시켜줍니다.

5. 하기 Table 2와 같이, 조직 유형에 적합한 프로그램을 실행시킵니다.

 Table 2.

6. 프로그램 작동이 끝났으면 C tube를 분리시켜주고 내용물을 재 현탁시켜 SmartStrainer가 끼워진 15㎖ Tube에 따라줍니다. 

   추가적으로 세포 수득률을 높이기 위해 10㎖의 RPMI1640 또는 DMEM으로 SmartStrainer의 filter를 씻어주는 작업을 추천 드립니다.

7. 마지막으로 세포 현탁액을 원심분리(300xg 7분)시키고 상층액을 분리시킴으로써 GMOH를 이용한 Sample Preparation 과정은 끝이 납니다.

[GMOH 와 TKDs의 장점]